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低溫保存生物樣品的失活率為什么那么高

2025-6-21 閱讀(13)

一、引言

低溫生物學(xué)是研究低溫環(huán)境對生物樣品的生長、發(fā)育、代謝、遺傳等影響和現(xiàn)象的一門學(xué)科,它是生物領(lǐng)域研究的一個重要分支。通常生物樣品的存儲需要在深冷條件(≤80℃)下才能進行長期的、穩(wěn)定的保存。這是因為生物樣品的代謝活動與溫度存在直接關(guān)系,其中有代表性的公式是由瑞典的阿倫尼烏斯所創(chuàng)立的化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)隨溫度變化關(guān)系的經(jīng)驗公式:

k=A×exp(?Ea/R×T) (1)

在上式(1)中,k為生物樣品的代謝反應(yīng)速率;A為代謝反應(yīng)常數(shù);R摩爾氣體常量,T為熱力學(xué)溫度,Ea為表觀活化能,A為指前因子(也稱頻率因子)。

由上式可以看出生物樣品的代謝反應(yīng)速率會隨著溫度的降低呈指數(shù)型減少,使得在深冷環(huán)境下細胞或組織的酶活性和代謝極大減慢或停滯。甚至有的生物樣品可在液氮(溫度-196℃)中保存多達幾百年??梢哉f完好的低溫保存重要生物制品是一個極其重要的研究方向。

二、低溫保存的方法

干細胞或其他生物樣品在低溫下能夠保存主要是因為水分是生物樣品的主要成分。而水在深冷的溫度下會以晶體狀態(tài)或玻璃態(tài)的方式存在,在這種狀態(tài)下,水分子之前存在很強的作用力,繼續(xù)不會擴散及相互作用,這就為細胞的冷凍保存提供了可能。

目前受到學(xué)界廣泛認可的是低溫生物學(xué)家Mazur在1972年提出的兩因素假說:即在生物樣品的低溫保存中,其保存效果一般受到兩個獨立因素的影響,其一是由與冷卻速率有關(guān)的胞內(nèi)冰形成的損傷,速率越快,其損傷越大;其二是溶質(zhì)損傷,由于冷卻的速率過慢,細胞在高溶質(zhì)的溶液中暴露的時間較長,損傷就越大。

低溫損傷的兩因素假說

現(xiàn)階段,低溫冷凍保存方式有兩種,分別是快速降溫保存和慢速降溫保存。快速降溫保存指的是迅速將生物樣品投入液氮罐中進行存儲。慢速降溫保存(也稱“兩步法“)是指先把生物樣品按照一定的冷凍程序降溫至-80℃,維持一段時間后,再投入到液氮中進行低溫存儲。

由于快速雖然操作方便、設(shè)備費用低,但由于細胞在快速投入液氮罐的過程中會因為降溫速率過快,細胞內(nèi)的水分會因為來不及滲透帶細胞膜外面,從而導(dǎo)致細胞內(nèi)水分會形成大量的冰晶改變細胞外形和尺寸,從而造成細胞復(fù)蘇活性很低,因此,結(jié)合實驗研究和臨床應(yīng)用,慢速降溫過程還是低溫保存生物制品的主流方法。

三、常用的液氮程序降溫儀的問題

液氮程序降溫儀采用液氮作為冷源,加熱盤管作為熱源,通過反饋溫度控制系統(tǒng),控制液氮給進電磁閥和加熱功率綜合調(diào)節(jié)腔體的溫度情況,使溫度按照設(shè)定程序進行低溫冷凍保存。

  1. 降溫過程中為了避免污染被降溫的生物樣品,感熱元件(主要是熱電偶)要么安裝在生物樣品容器表面,讀取的實際是樣品外部溫度,會造成讀取生物樣品溫度的誤差;要么就采取熱電偶侵入一組樣品內(nèi)部(凍存袋或者凍存管),這樣熱電偶的重金屬會污染被侵入的樣品內(nèi)部的細胞懸浮液,造成被測溫的一組樣品報廢,從而形成浪費。
  2. 由于液氮程序降溫儀使用液氮噴灑達到降溫效果、同時使用設(shè)備內(nèi)的電鎢絲加熱升溫的工作方式以達到精準(zhǔn)控制樣品溫度。由于液氮程序降溫儀是使用反饋控制方式精確控制的液氮噴口的電磁閥會頻繁的進行開、斷操作,這樣會極大降低電磁閥的壽命。此外。因此會使諸如電磁閥、電鎢絲、液氮噴口和設(shè)備的密封材料等原件經(jīng)歷的溫差變化,導(dǎo)致它們非常容易損壞。
  3. 液氮程序降溫儀采用淋灑的方式進行降溫的過程中由于腔體設(shè)計原因,液氮噴嘴、加熱盤管、熱電偶位置相差較大,存在溫度調(diào)節(jié)的滯后性和腔體溫度的不均一,生物樣品的溫度調(diào)節(jié)
  4. 設(shè)備的造價昂貴:一套設(shè)備價格在20萬以上,日常降溫過程中需要耗費大量的液氮(根據(jù)河北省干細胞庫提供的數(shù)據(jù),按照僅僅1臺設(shè)備,按照每天降溫3次計算,每年需要消耗5萬多元的液氮),此外還存在設(shè)備的保養(yǎng)費昂貴(1500元/年)、后續(xù)維修費也很貴(僅更換液氮噴頭就需要2萬元/只)。這些不利的因素導(dǎo)致了液氮程序降溫儀使用成本過高。
  5. 在液氮程序降溫儀工作期間,需要工作人員全程職守在液氮程序降溫儀。邊上,防止出現(xiàn)液氮噴口堵塞或者液氮耗盡等情況發(fā)生。整個降溫過程操作人員不能離開儀器,耗時耗力。

四、點成推薦 | CRF-1免液氮程序降溫儀

點成CRF-1免液氮程序降溫儀無需液氮和冷凍劑,采用斯特林循環(huán)引擎(Stirling Cycle Engine),可提供精確的、重現(xiàn)性的生物制冷效果,尤其是在重要的成核/播種階段,這就確保了細胞解凍后的恢復(fù)。該儀器適合用于多種材料的冷凍保存,包括胚胎、干細胞、哺乳動物細胞、精子、抗體、組織切片和嚙齒動物器官。

CRF-1臺式設(shè)計,外形精巧,根據(jù)冷凍后的細胞存活率顯示,其性能比同類液氮降溫儀更優(yōu)。操作簡單,有無PC連接都可進行;數(shù)據(jù)可以通過PC軟件進行記錄,冷卻數(shù)據(jù)將直接顯示在PC屏幕上。不同的冷卻數(shù)據(jù)可通過下拉菜單獲取,并且可以編寫自定義的配置文件。

參考文獻:

  • 黃昱. 被動傳熱的降溫速率控制方法及其在細胞冷凍保存中的應(yīng)用[D]. 2018.
  • 劉靜. 低溫生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)原理[M]. 科學(xué)出版社, 2007.
  • 劉曉利. 脂肪間充質(zhì)干細胞及其構(gòu)建物新型低溫保存方法研究[D]. 2018.


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