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前言

宿主細(xì)胞蛋白 (Host Cell Protein, HCP) 是細(xì)胞生長(zhǎng)和后續(xù)生產(chǎn)工藝中來源于宿主細(xì)胞系的生物藥品雜質(zhì)，會(huì)對(duì)藥品最終的安全性和有效性產(chǎn)生不利影響。因此，必須通過一系列純化步驟去除這些 HCP。國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)、美國(guó)食品和藥物管理局 (U.S. FDA)、歐洲藥品管理局 (EMA) 和其他國(guó)家的監(jiān)管機(jī)構(gòu)都有關(guān)于 HCP 監(jiān)測(cè)的指南。

在本文的研究中，我們對(duì)三個(gè)來自于下游生產(chǎn)工藝不同純化階段的樣品進(jìn)行了基于LC-MS高分辨質(zhì)譜串聯(lián)平臺(tái)的定性及定量分析，并對(duì)每個(gè)樣品中存在的高風(fēng)險(xiǎn)HCP進(jìn)行了特別標(biāo)注。分析流程請(qǐng)見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)整體流程

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在經(jīng)過一步ProteinA純化后的樣品中，鑒定到676個(gè)具有定量信息的HCP（peptide≥3,下同）；再經(jīng)過一步陰離子交換色譜（AEX）純化后，HCP數(shù)目下降至111；在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行一步陽(yáng)離子交換色譜（CEX）純化后，僅檢測(cè)到7個(gè)HCP。三個(gè)樣品中定性及定量的HCP數(shù)目請(qǐng)見表1。

表1 不同純化階段樣品中定性并定量的HCP，所有數(shù)據(jù)均為三次生物重復(fù)的平均值

對(duì)于會(huì)引起免疫響應(yīng)、降解蛋白或輔料的高風(fēng)險(xiǎn)HCP是科學(xué)家們?cè)诋a(chǎn)品工藝的優(yōu)化過程中尤為注意的。圖2展示了隨著純化步驟的增多，高風(fēng)險(xiǎn)HCP數(shù)目呈減少趨勢(shì)。圖3展示了經(jīng)過三步純化后依然能夠鑒定到的三個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)HCP及其各自的含量。

圖2. 不同樣品中高風(fēng)險(xiǎn)HCP數(shù)目變化趨勢(shì)

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圖3. 經(jīng)過三步純化后樣品中依然能鑒定到的高風(fēng)險(xiǎn)HCP（點(diǎn)擊查看大圖）

本實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均是由一站式生物制藥分析軟件BioPharma Finder4.1處理。該軟件內(nèi)置HCP分析功能，可同時(shí)對(duì)目標(biāo)蛋白和HCP進(jìn)行搜庫(kù)、定性和定量（圖4~6）。

圖4 HCP鑒定結(jié)果展示界面

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圖5 同一個(gè)HCP在不同樣品中的變化趨勢(shì)，每個(gè)樣品均進(jìn)行了三針技術(shù)重復(fù)（點(diǎn)擊查看大圖）

圖6 三步純化后一條來源于高風(fēng)險(xiǎn)HCP肽段的二級(jí)譜圖及覆蓋率（點(diǎn)擊查看大圖）

客戶得益

用非變性酶解條件進(jìn)行 HCP 鑒定和相對(duì)定量的工作流程，然后進(jìn)行 LC-MS/MS 分析。

使用 UHPLC 系統(tǒng)和高分辨率精確質(zhì)量 (HRAM) 質(zhì)譜儀在寬動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)進(jìn)行HCP定性與相對(duì)定量，靈敏度可低至約 1ppm。

為各個(gè) HCP 提供定性和定量信息，可用于指導(dǎo)下游工藝開發(fā)和優(yōu)化決策。

證明 POROS 樹脂具有高選擇性，可有效去除不同含量和種類的 HCP。

Biopharma Finder 4.1單一軟件解決方案，可同時(shí)提供目標(biāo)蛋白的肽圖分析結(jié)果及HCP的定性定量結(jié)果。

本研究中使用的樣品由賽默飛生物工藝部下屬的生物工藝設(shè)計(jì)（Bioprocess Design Center, BDC）所提供。該中心總監(jiān)馬駿表示，近年來，有關(guān)抗體藥品中的HCP可能導(dǎo)致臨床不良反應(yīng)的報(bào)道屢見不鮮，其中某些高風(fēng)險(xiǎn)HCP被發(fā)現(xiàn)可能是導(dǎo)致不良反應(yīng)的主要因素。這些案例從客觀上對(duì)我們提出了一個(gè)新要求：在抗體藥物的CMC開發(fā)過程中，越早對(duì)HCP進(jìn)行更進(jìn)一步的分析鑒別，越快在工藝開發(fā)中去除高風(fēng)險(xiǎn)HCP，就越有利于該藥品在臨床階段的成功，而LC-MS聯(lián)用的方法無疑為這一需求提供了可靠的工具。