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細(xì)胞計(jì)數(shù)專題 | 使用點(diǎn)成LUNA-FX7™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)原生質(zhì)體:熒光染料組合

來源:廣州虹科電子科技有限公司   2025年06月21日 12:13   6

原生質(zhì)體是通過酶解或機(jī)械方法去除細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。這些無細(xì)胞壁的球形植物細(xì)胞具有性等特性,使其成為植物科學(xué)研究的多功能工具。它們可作為實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可用于探索植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、化學(xué)特性及功能。

傳統(tǒng)活力評估需將原生質(zhì)體培養(yǎng)至發(fā)育成完整植株,但該方法無法實(shí)現(xiàn)即時(shí)的活力評估。點(diǎn)成LUNA-FX7™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀用不同顏色的熒光染料,通過雙重染色法快速測定活力,但需了解該設(shè)備在不同染料條件下的表現(xiàn)并調(diào)整分析參數(shù)。本研究旨在確定使用點(diǎn)成LUNA-FX7™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀評估原生質(zhì)體活力的染料組合及參數(shù)設(shè)置。

1. 原生質(zhì)體分離與染色

原生質(zhì)體分離步驟

1.準(zhǔn)備5克幼苗,依次用乙醇和蒸餾水各清洗1次和2次。2.用紙巾吸干水分后置于培養(yǎng)皿中,用剪刀細(xì)切。3.加入25ml消化緩沖液混勻,轉(zhuǎn)移至50ml離心管并用錫箔紙遮蓋避光。4.置于搖床上以20轉(zhuǎn)/每分鐘轉(zhuǎn)速培養(yǎng)6小時(shí)。5.培養(yǎng)后加入20ml洗滌緩沖液,輕輕混勻后經(jīng)100 μm濾網(wǎng)過濾。6.100 g離心3分鐘。7.去除上清液,加20ml洗滌緩沖液混勻后經(jīng)40 μm濾網(wǎng)過濾。8.再次100 g離心3分鐘。9.去除上清液,用3ml洗滌緩沖液重懸沉淀。

熒光染色步驟

1. 混合:

  • 18 μL原生質(zhì)體細(xì)胞

  • 2 μL綠/紅熒光染料等體積混合液

2. 2.取10 μL染色細(xì)胞懸液樣本上樣

3. 使用點(diǎn)成LUNA-FX7™進(jìn)行分析

* 注意:原生質(zhì)體尺寸差異大,可能表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度。請根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整

表1:點(diǎn)成LUNA-FX7™熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)模式下原生質(zhì)體計(jì)數(shù)的建議參數(shù)

2. 用于活性測定的染料

我們選擇了五種常用的用于活性評估的染料:

3. 原生質(zhì)體活力評估的熒光染料組合

FDA/PI或FDA/EthD-1是原生質(zhì)體活力評估的(圖1)。PI和EthD-1均能有效染色原生質(zhì)體核,但需要將紅光曝光水平調(diào)至9才能檢測到充足信號(表1)。
在測試的綠色熒光染料中,僅FDA無需調(diào)整綠光曝光水平即可產(chǎn)生明亮可靠的信號。FDA和Calcein AM雖均依賴酯酶活性產(chǎn)生信號,但Calcein AM幾乎無信號響應(yīng)。需特別注意的是,F(xiàn)DA在持久培養(yǎng)時(shí)間中可能產(chǎn)生較高的背景噪音,建議在染色后立即進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以獲得的活力評估結(jié)果。如果信號過強(qiáng),可以通過調(diào)整綠光曝光水平進(jìn)行優(yōu)化。此外,盡管AO通常被認(rèn)為能染色所有細(xì)胞,但其熒光強(qiáng)度顯著降低。

圖 1:分離原生質(zhì)體的染色結(jié)果。原生質(zhì)體經(jīng)FDA/PI或FDA/EthD-1染色,而AO/PI或EthD-1、Calcein AM/PI或EthD-1均未顯示綠色信號。FL:綠色和紅色熒光通道合并圖像。Tag:所有通道(熒光和明場)合成圖像,檢測目標(biāo)以紅/綠圈標(biāo)記,紅圈表示死細(xì)胞,綠圈表示活細(xì)胞。

4. 緩沖液對綠色熒光染料性能的影響

盡管AO能夠染色所有細(xì)胞(無論死活),但其在原生質(zhì)體中低信號異常促使我們進(jìn)一步研究。我們在哺乳動物細(xì)胞(如U937細(xì)胞)上使用綠色染料進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并使用PBS或洗滌培養(yǎng)基作為緩沖液,采用默認(rèn)分析方案評估緩沖液對染料信號的影響。結(jié)果顯示:AO信號強(qiáng)度在洗滌緩沖液中較PBS顯著降低(圖2A);Calcein AM在洗滌緩沖液中信號穩(wěn)定性提升,F(xiàn)DA信號受緩沖液類型影響較小,僅強(qiáng)度輕微下降(圖2B和圖2C)。
導(dǎo)致這些差異的具體因素尚不明確,但緩沖液的滲透壓和pH值差異可能會影響細(xì)胞狀態(tài)和染料性能。例如,AO在不同pH值下可能顯示不同顏色。而滲透壓的差異會使細(xì)胞大小從13 µm左右縮小至1-2 µm。綜合考慮這些因素,化學(xué)條件的變化可能通過多種機(jī)制影響染料表現(xiàn)。

圖2 不同緩沖液對AO(A)、Calcein AM(B)及FDA(C)在U937細(xì)胞中染色性能的影響。AO信號在洗滌培養(yǎng)基中減弱,Calcein AM性能改善,F(xiàn)DA則無明顯變化。BF:明場圖像FL-Tag:熒光通道合并圖像,檢測目標(biāo)以紅/綠圈標(biāo)記。紅色圓圈表示死細(xì)胞,綠色圓圈表示活細(xì)胞。

結(jié)論

FDA/PI或DA/EthD-1是的原生質(zhì)體染色活力評估組合。FDA始終產(chǎn)生可靠的信號,但應(yīng)在染色后立即進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以盡量減少培養(yǎng)期間的噪音。Calcein AM的性能因細(xì)胞類型和緩沖液而異。值得注意的是,AO信號在洗滌培養(yǎng)基中顯著降低。此外,PI和EthD-1對原生質(zhì)體的染色效果良好,但需將紅光曝光水平從5調(diào)至9。

總之,點(diǎn)成LUNA-FX7™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀通過優(yōu)化染料組合與分析參數(shù),可為原生質(zhì)體活力評估提供高效解決方案

點(diǎn)成LUNA-FX7™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

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