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細(xì)胞計數(shù)專題 | 熒光染料與自動細(xì)胞計數(shù)儀:單細(xì)胞基因組學(xué)中可靠的核質(zhì)量評估

來源:廣州虹科電子科技有限公司   2025年06月21日 12:26   14

在單細(xì)胞基因組學(xué)研究中,準(zhǔn)確評估細(xì)胞核質(zhì)量至關(guān)重要。將熒光染料與自動細(xì)胞計數(shù)儀等成像工具結(jié)合使用,是評估細(xì)胞核質(zhì)量的有效方法。在眾多熒光染料中,選擇組合以評估核質(zhì)量對于確保結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。

此外,隨著現(xiàn)代自動細(xì)胞計數(shù)儀(如點成LUNA-FX7™點成LUNA-FL™)功能日益強大,深入了解這些系統(tǒng)在不同熒光染料組合下的表現(xiàn)顯得尤為必要。本研究旨在通過分析不同細(xì)胞類型、不同系統(tǒng)以及核固定條件下的熒光染料組合,找出的評估核質(zhì)量的方法。我們希望通過全面的分析,為單細(xì)胞基因組學(xué)研究中的核質(zhì)量評估程序提供優(yōu)化指導(dǎo)并提高評估的準(zhǔn)確性。

1. 材料與方法

本研究使用了四種不同的熒光染料,且每種染料的最終濃度均有所不同:28 µM的嘧啶橙(AO),12.5 µM的鈣黃素(AM),15 µM的碘化丙啶(PI),以及20 µM的EthD-1。這些染料組合成AO/PI、AO/EthD-1、Calcein AM/PI和Calcein AM/EthD-1四種染料。每種組合取各染料1µL,總體積為2µL,隨后與18 µL細(xì)胞樣本混合。

2. 核質(zhì)量評估的熒光染料組合

實驗旨在找出的染料組合,使用不同熒光染料評估U937細(xì)胞核和3T3細(xì)胞核的質(zhì)量。理論上,完整的細(xì)胞應(yīng)僅被膜透性染料(如AO和Calcein AM)選擇性染色。而去除膜后的分離細(xì)胞核則應(yīng)被非膜透性染料(如PI和EthD-1)染色,顯示出與死亡細(xì)胞類似的活性狀態(tài)。
在AO/PI、AO/EthD-1、Calcein AM/PI和Calcein AM/EthD-1這四種染料組合中,AO與PI或AO與EthD-1的組合能夠準(zhǔn)確顯示完整細(xì)胞和分離細(xì)胞核的活性(圖1A)。綠色和紅色信號的存在,使其能夠有效檢測U937細(xì)胞和3T3細(xì)胞的活性。然而,在3T3細(xì)胞中幾乎沒有檢測到Calcein AM信號,而在U937細(xì)胞中約有三分之二的細(xì)胞顯示出Calcein AM信號(圖1B)。這種差異可以歸因于Calcein AM對酯酶活性的依賴性,而酯酶活性可能因不同細(xì)胞類型而異。因此,使用Calcein AM會遺漏部分完整細(xì)胞,從而降低活性評估的可靠性。

圖1.(A) 使用AO和PI組合以及AO和EthD-1組合對U937細(xì)胞和3T3細(xì)胞的染色結(jié)果。(B)使用Calcein AM和PI組合以及Calcein AM和EthD-1組合對U937細(xì)胞和3T3細(xì)胞的染色結(jié)果。

3. 定量核質(zhì)量評估

點成LUNA-FX7™點成LUNA-FL™系統(tǒng)是功能強大的分析平臺,能夠無縫捕獲明場圖像和熒光圖像,并通過熒光信號分析獲得細(xì)胞大小、活性和數(shù)量等寶貴數(shù)據(jù)。

評估分離核質(zhì)量時,可利用這些系統(tǒng)提供的平均細(xì)胞大小數(shù)據(jù)。例如,去除膜后的細(xì)胞核尺寸顯著小于完整細(xì)胞,這是因為去除細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)會使細(xì)胞大小減少數(shù)微米。特別的是,點成LUNA-FL™點成LUNA-FX7™能夠從明場圖像中提取細(xì)胞大小信息,因此能地避免因熒光強度可能引起的細(xì)胞大小測量偏差。這確保了在評估分離核質(zhì)量時,細(xì)胞大小測量的可靠性更高。

采用熒光染料檢測細(xì)胞活性是核質(zhì)量評估的另一個有用數(shù)據(jù)。如圖1所示,當(dāng)使用AO/PI或AO/EthD-1組合時,健康的完整細(xì)胞顯示接近99%的活性,而分離核顯示接近0%的活性值。像點成LUNA-FL™點成LUNA-FX7™這樣的自動細(xì)胞計數(shù)儀能夠在這些染料的作用下,準(zhǔn)確量化分離核的濃度(圖2)。這些結(jié)果提供了重要數(shù)據(jù),驗證了核質(zhì)量,為后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖2. 顯示使用不同染料組合(AO/PI和AO/EthD-1)對U937細(xì)胞和3T3細(xì)胞染色結(jié)果的拼接圖。圖中還展示了來自點成LUNA-FX7™(A)和點成LUNA-FL™(B)的定量分析結(jié)果。

4. PFA固定后的核染色

核固定是長期保存的常見操作,因為它有助于保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)并便于后續(xù)分析。因此,為驗證上述核質(zhì)量評估方法是否適用于固定的核,我們使用AO/PI和AO/EthD-1對PFA固定的核進(jìn)行測試。使用AO/PI染料組合時,無論固定狀態(tài)或染料培養(yǎng)時間如何,均可觀察到明顯且強烈的PI熒光信號,這表明AO/PI染料可用于新鮮的分離核和固定核分析。然而使用AO/EthD-1時,固定核的EthD-1紅色熒光信號減少,即使延長染料培養(yǎng)時間,熒光信號也沒有增加。為解決這一問題,我們調(diào)整了自動細(xì)胞計數(shù)儀的曝光值,將其從默認(rèn)的5增加到8。這一調(diào)整產(chǎn)生了更強的紅色信號,與AO/PI組合的效果相當(dāng)。這些結(jié)果表明,使用AO/EthD-1染料時,固定核的熒光信號會有所減弱,因此可能需要調(diào)整自動細(xì)胞計數(shù)儀的參數(shù)。

圖 3. 顯示使用AO/PI和AO/EthD-1對核在PFA固定前后染色結(jié)果的拼接圖。右側(cè)還展示了使用曝光設(shè)置為8時獲得的圖像。

結(jié)論

在快速發(fā)展的單細(xì)胞基因組學(xué)研究領(lǐng)域,精確評估核質(zhì)量是實現(xiàn)可靠研究結(jié)果的基石。研究評估的染料組合中,AO/PI和AO/EthD-1在區(qū)分完整細(xì)胞與分離核的活性差異方面表現(xiàn)出色。值得注意的是,AO/PI對新鮮核和固定核均表現(xiàn)出良好的效果,而AO/EthD-1在固定核的應(yīng)用中需要優(yōu)化。本研究通過結(jié)合適當(dāng)?shù)娜玖辖M合與的點成LUNA-FX7™點成LUNA-FL™系統(tǒng),提出了一種高效且可靠的分離核質(zhì)量評估方法。這一成熟的方法為核質(zhì)量評估提供了寶貴的技術(shù)手段,從而推動了單細(xì)胞基因組學(xué)研究的進(jìn)步。

點成LUNA-FX7™
點成LUNA-FL™

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