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現(xiàn)代細(xì)胞計(jì)數(shù)儀采用自動化方法，在特定濃度范圍內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。其上限受限于在高濃度條件下準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞邊界的能力，而相機(jī)視野等因素則決定了下限。在圖像中僅包含少量可識別細(xì)胞或特征的情況下，自動對焦可能會失效，從而影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，并導(dǎo)致變異系數(shù)（CV）升高。在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，只要細(xì)胞濃度足夠，這通常不是主要問題。但當(dāng)細(xì)胞樣本濃度極低時，例如在細(xì)胞治療產(chǎn)品制造的初始種子培養(yǎng)階段，對焦精確度就變得尤為關(guān)鍵。在此類情況下，確保在極低細(xì)胞濃度條件下獲得清晰的圖像是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)細(xì)胞計(jì)數(shù)的關(guān)鍵。
為了解決這一問題，我們開發(fā)了一種全新的自動對焦算法，采用技術(shù)準(zhǔn)確識別圖像中的特征。本技術(shù)說明介紹了點(diǎn)成LUNA-FX7™軟件版本（v1.9.1及以上）的更新內(nèi)容，該版本針對極低濃度樣本優(yōu)化了自動對焦功能。此外，本文還展示了點(diǎn)成LUNA-FX7™全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的性能。
點(diǎn)成LUNA-FX7™系統(tǒng)采用基于圖像對比度的自動對焦算法，以優(yōu)化聚焦性能。其自動對焦過程由粗略掃描和精細(xì)掃描兩個階段組成，確保點(diǎn)成LUNA-FX7™系統(tǒng)具備的對焦能力（圖1）。
該過程首行粗略掃描，在較寬的Z軸范圍內(nèi)采集圖像，以覆蓋更大的景深范圍，并確定一個大致的焦平面。隨后，系統(tǒng)執(zhí)行精細(xì)掃描，在更小范圍的Z軸平面上進(jìn)一步調(diào)整焦點(diǎn)，以精準(zhǔn)定位最準(zhǔn)確的焦平面。該優(yōu)化過程基于圖像特征，確保點(diǎn)成LUNA-FX7™系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對焦性能。
圖1：圖中顯示了LUNA-FX7系統(tǒng)自動對焦過程的工作流程，包括粗略掃描和精細(xì)掃描
依賴圖像對比度的自動對焦算法在目標(biāo)物較少或圖像特征有限的情況下可能會遇到挑戰(zhàn)，從而難以準(zhǔn)確確定合適的焦點(diǎn)位置。這一問題通常在粗略掃描階段較為明顯，此時系統(tǒng)難以識別適當(dāng)?shù)腪軸平面，進(jìn)而導(dǎo)致后續(xù)精細(xì)掃描過程中的對焦失敗（圖2A）。
為解決這一問題，我們開發(fā)了一種全新的算法，以增強(qiáng)低細(xì)胞濃度或圖像特征較少情況下的特征識別能力（圖2B）。這種改進(jìn)算法顯著提升了自動對焦過程的準(zhǔn)確性和可靠性，在具有挑戰(zhàn)性的場景下提供更加精準(zhǔn)、穩(wěn)定的對焦結(jié)果。
不同算法在對焦性能上的對比
(A) 算法1未能找到正確的焦點(diǎn)，導(dǎo)致圖像模糊，清晰度較差。
(B) 算法2成功識別出合適的焦點(diǎn)位置，呈現(xiàn)出清洗銳利的圖像。
為了驗(yàn)證并展示新開發(fā)的自動對焦算法的有效性，我們使用相同的樣本對不同版本的點(diǎn)成LUNA-FX7™軟件進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)該自動對焦算法的性能得到了顯著提升。這一重要改進(jìn)得益于綜合優(yōu)化策略的實(shí)施，有效增強(qiáng)了目標(biāo)檢測的靈敏度，從而在所有視野范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)更加精準(zhǔn)和穩(wěn)定的對焦位置（圖3）。
升級后的算法即使在圖像中目標(biāo)物數(shù)量極少的復(fù)雜場景下，依然能夠精準(zhǔn)定位焦點(diǎn)。在每幅圖像目標(biāo)物少于5個的極低細(xì)胞濃度條件下，算法仍能穩(wěn)定提供準(zhǔn)確的對焦結(jié)果，充分體現(xiàn)了其的可靠性和適應(yīng)性。
U937細(xì)胞被稀釋至2.54 × 10? 個/mL的濃度，使每幅圖像中的目標(biāo)物數(shù)量少于5個。完整的12個視野（FOVs）展示如下。算法2能夠有效檢測并識別目標(biāo)物（A），而算法1未能實(shí)現(xiàn)理想的對焦效果（B）。
點(diǎn)成LUNA-FX7™系統(tǒng)在極低細(xì)胞濃度條件下依然能夠?qū)崿F(xiàn)高精度細(xì)胞計(jì)數(shù)。我們優(yōu)化的自動對焦算法采用綜合增強(qiáng)策略，有效提高了目標(biāo)檢測的靈敏度，使對焦性能顯著提升。即使在目標(biāo)物或圖像特征有限的情況下，該算法仍能精準(zhǔn)識別焦點(diǎn)位置。
這些技術(shù)升級使LUNA-FX7™系統(tǒng)成為復(fù)雜環(huán)境下可靠且高效的細(xì)胞計(jì)數(shù)解決方案。全新自動對焦算法已應(yīng)用于點(diǎn)成LUNA-FX7™軟件版本1.9.1及以上。
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