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在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，外周血單核細(xì)胞（PBMC）研究是許多重大科研項(xiàng)目的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，無論是感染性疾病、自身免疫疾病，還是腫瘤免疫學(xué)的研究，PBMC 都扮演著的角色。然而，PBMC 的精確計(jì)數(shù)一直是個(gè)讓人頭疼的難題。
PBMC 體積小巧，細(xì)胞邊緣模糊不清，這使得檢測(cè)時(shí)難以精準(zhǔn)識(shí)別；而且在樣本分離過程中，大量細(xì)胞碎片和潛在的紅細(xì)胞污染問題頻發(fā)，這些干擾因素嚴(yán)重影響自動(dòng)對(duì)焦性能，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力測(cè)定出現(xiàn)誤差，讓科研結(jié)果的準(zhǔn)確性大打折扣。
為了突破這一困境，科研設(shè)備不斷升級(jí)革新?；跓晒鈾z測(cè)的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，如 點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，成為了提高 PBMC 計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性的常用選擇。但對(duì)于追求高性價(jià)比，希望僅依靠明場(chǎng)光學(xué)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)計(jì)數(shù)的科研工作者而言，挑戰(zhàn)依然存在。
點(diǎn)成LUNA-III™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀應(yīng)運(yùn)而生，它創(chuàng)新性地融合了焦平面偏移校正技術(shù)和優(yōu)化的細(xì)胞檢測(cè)算法，并配合臺(tái)盼藍(lán)染色，為 PBMC 計(jì)數(shù)難題提供了新的解決方案。那么，它在實(shí)際應(yīng)用中的表現(xiàn)究竟如何呢？接下來，我們將通過對(duì)比 LUNA-III™和 LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在 PBMC 計(jì)數(shù)和活力測(cè)定中的表現(xiàn)，一探究竟。
首先采集人外周血，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)密度梯度離心法，借助 Histopaque – 1083（Sigma，#10831）成功分離出 PBMC 樣本。完成分離后，將富含血沉棕黃層的 PBMC 重懸于含 1% BSA 的 PBS 溶液中備用。
在系列稀釋測(cè)定環(huán)節(jié)，把 PBMC 按照 1 至 32 倍的不同稀釋因子進(jìn)行梯度稀釋。同時(shí)，精心制備了一批用于活力測(cè)定的 PBMC 樣本，并分別設(shè)定理論細(xì)胞活力水平為 0%、25%、50%、75% 和 99% 。
計(jì)數(shù)和活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)使用點(diǎn)成LUNA-III™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，搭配LUNA™細(xì)胞計(jì)數(shù)專用載片，并啟用內(nèi)置的 PBMC 計(jì)數(shù)程序（具體參數(shù)設(shè)置詳見表 1）。在樣本上機(jī)前，將細(xì)胞樣本與 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)溶液（貨號(hào) T13001）按照 1:1 的體積比充分混合。為了對(duì)比分析，同一批樣本也會(huì)用點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)試。
#細(xì)胞濃度檢測(cè)結(jié)果 #
使用 點(diǎn)成LUNA-III™和 點(diǎn)成LUNA-FX7™在三個(gè)不同的偏移水平（0、1 和 2）下對(duì) PBMC 樣本進(jìn)行測(cè)試，以此驗(yàn)證在不同濃度和活力水平下的線性關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，所有偏移水平下，點(diǎn)成LUNA-III™測(cè)得的細(xì)胞濃度與理論細(xì)胞濃度均表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，R2 值均在 0.9921 以上（見圖 1A）。這表明點(diǎn)成 LUNA-III™在細(xì)胞濃度檢測(cè)方面具有較高的可靠性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，偏移水平 2 的測(cè)量結(jié)果與點(diǎn)成 LUNA-FX7™的數(shù)據(jù)接近。而且，從圖 1B 中可以直觀看到，點(diǎn)成LUNA-III™能夠精準(zhǔn)識(shí)別并標(biāo)記 PBMC，隨著稀釋倍數(shù)從 1 到 32 變化，檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)量也呈現(xiàn)出相應(yīng)的變化趨勢(shì)。
圖 1. (A) 在不同稀釋梯度的 PBMC 樣本中，點(diǎn)成LUNA-III™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)與理論細(xì)胞濃度之間的線性關(guān)系。(B) 使用點(diǎn)成 LUNA-III™ BF-total 模式檢測(cè)不同稀釋水平的代表性圖像。橙色圓圈標(biāo)記點(diǎn)成 LUNA-III™ 識(shí)別出的細(xì)胞，檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)量從左至右逐漸增加，對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)范圍為 1 至 32。BF-total：測(cè)量細(xì)胞總數(shù)的明場(chǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)模式。
#細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果 #
在細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，同樣在三個(gè)偏移水平（0、1 和 2）下進(jìn)行測(cè)試，并與點(diǎn)成 LUNA-FX7™的活力數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果顯示，偏移水平 1 和 2 與理論活力值相關(guān)性較強(qiáng)（R2 = 0.9906 和 0.9987），但只有偏移水平 2 的結(jié)果與點(diǎn)成 LUNA-FX7™數(shù)據(jù)高度一致（見圖 2A）。偏移水平 0 與理論活力值的相關(guān)性較低（R2 = 0.9579），且測(cè)量結(jié)果與點(diǎn)成 LUNA-FX7™存在較大偏差。從圖 2B 的細(xì)胞活力標(biāo)記示例圖中可以清晰看到，在點(diǎn)成 LUNA-III™系統(tǒng)中，偏移水平 2 對(duì)不同活力水平的活細(xì)胞與死細(xì)胞標(biāo)記準(zhǔn)確。
圖2. (A) 比較點(diǎn)成 LUNA-III™ 在三個(gè)偏移水平(0?1 和 2)下測(cè)得的細(xì)胞活力與點(diǎn)成 LUNA-FX7™ 的測(cè)量結(jié)果? (B)點(diǎn)成 LUNA-III™ 在偏移水平 0?1 和 2 下的細(xì)胞活力標(biāo)記示例圖?紅色圓圈表示死亡細(xì)胞,綠色圓圈表示存活細(xì)胞? *點(diǎn)成LUNA-FX7™ BF-Viability:點(diǎn)成LUNA-FX7™ 使用明場(chǎng)成像評(píng)估細(xì)胞活力的計(jì)數(shù)模式?
盡管點(diǎn)成 LUNA-III™在 PBMC 計(jì)數(shù)和活力評(píng)估方面表現(xiàn)出色，但臺(tái)盼藍(lán)染色法本身存在顯著局限性。臺(tái)盼藍(lán)染色法無法有效區(qū)分 PBMC 與污染物，如紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片。這就可能導(dǎo)致總細(xì)胞計(jì)數(shù)出現(xiàn)過高估算的情況，同時(shí)細(xì)胞活性評(píng)估也會(huì)不準(zhǔn)確，因?yàn)槲廴疚锖芸赡鼙徽`計(jì)為死亡細(xì)胞。
相比之下，像點(diǎn)成 LUNA-FX7™等基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀所采用的熒光染色方法，能夠選擇性地識(shí)別活細(xì)胞和死亡細(xì)胞，還能有效排除污染物干擾，從而提供更為精準(zhǔn)的評(píng)估結(jié)果。所以，當(dāng)處理可能含有紅細(xì)胞或碎片的 PBMC 樣本，且對(duì)細(xì)胞活性和總細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度要求較高時(shí)，強(qiáng)烈建議使用熒光染色方法。
點(diǎn)成LUNA-III™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀憑借集成的焦平面偏移和的細(xì)胞檢測(cè)算法，顯著提升了 PBMC 計(jì)數(shù)和活性評(píng)估的準(zhǔn)確性與精確度。尤其是偏移級(jí)別 2，其表現(xiàn)與高性能的點(diǎn)成 LUNA-FX7™相當(dāng)，為科研工作者提供了一種經(jīng)濟(jì)高效的選擇。
然而，我們必須認(rèn)識(shí)到，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行 PBMC 計(jì)數(shù)時(shí)，存在無法區(qū)分污染物的問題?？蒲腥藛T在實(shí)際操作過程中，需要充分考慮這些局限性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求謹(jǐn)慎選擇合適的檢測(cè)方法和設(shè)備。希望未來能有更多創(chuàng)新技術(shù)出現(xiàn)，進(jìn)一步完善 PBMC 計(jì)數(shù)和活力評(píng)估的解決方案，推動(dòng)生命科學(xué)研究不斷向前發(fā)展。
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