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微流控專題 | 抑制NADPH氧化酶阻斷NETosis并減少肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥中的血栓形成

來源:廣州虹科電子科技有限公司   2025年06月21日 09:06   8
肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥 (HIT) 是對抗凝劑肝素的嚴(yán)重免疫反應(yīng)。該病癥表現(xiàn)為血小板減少癥(血小板計(jì)數(shù)低)和動脈或靜脈血栓形成。如果不及時治療,HIT 可導(dǎo)致心臟病發(fā)作、中風(fēng)、肺栓塞、動脈阻塞、肢體壞疽和死亡。

在 HIT 中,抗體識別血小板因子 4 (PF4) 和肝素或多聚陰離子并與之形成復(fù)合物。該免疫復(fù)合物與 Fc?RIIa 受體相互作用,導(dǎo)致血小板活化和聚集。血小板活化會導(dǎo)致釋放刺激凝血并延續(xù)循環(huán)的因子。

但其他因素會導(dǎo)致 HIT 中的血栓形成,例如中性粒細(xì)胞活化。HIT 免疫復(fù)合物與中性粒細(xì)胞上的 Fc?RIIa 受體的結(jié)合會誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外陷阱 (NET) 的釋放和 NETosis,這是一種受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過程。

到目前為止,HIT 中 NET 形成的分子機(jī)制尚未了解??赡苌婕疤囟觿缍塑账崃姿?(NADPH)、氧化酶 (NOX) 和氧物種 (ROS)。新南威爾士大學(xué) (澳大利亞悉尼) 的研究人員調(diào)查了 ROS 和 NOX 是否是 HIT 誘發(fā)的血栓形成所必需的,以便更好地了解這些機(jī)制。

研究概述

HIT 樣本

研究人員從健康志愿者和 HIT 患者身上采集血液樣本。

微流體研究

該小組使用 點(diǎn)成Vena8 Fluoro+ 生物芯片微通道進(jìn)行了微流體研究。

首先,他們在 4C 下用纖維蛋白原或血管性血友病因子 (WWF) 覆蓋微芯片過夜。用牛血清清洗和阻斷微芯片后,他們用 DPI(一種 ROS 抑制劑)孵育來自健康供體的新鮮檸檬酸抗凝全血。他們用純化的 IgG(HIT 或正常)和肝素對其進(jìn)行處理。

針對中性粒細(xì)胞的 ROS 抑制試驗(yàn)

研究人員在本次實(shí)驗(yàn)中使用了經(jīng)過或未經(jīng)過 DPI 處理的中性粒細(xì)胞耗盡血液。他們用 Hoechst 33342、Sytox Green、抗 CD41 或 AP2、抗 CD15 和 CellROX 標(biāo)記樣本。然后,他們以 67 達(dá)因/cm2(1500 s-1)的剪切應(yīng)力灌注血液長達(dá) 30 分鐘。

為了可視化生物芯片,他們使用 Q-Imaging EXi Blue 相機(jī)連接到由 VenaFluxAssay 軟件(點(diǎn)成Cellix Ltd)驅(qū)動的熒光顯微鏡,然后進(jìn)行定量分析。

結(jié)果

HIT 中的血栓形成需要中性粒細(xì)胞衍生的 ROS

當(dāng)研究人員分析血栓時,他們看到血凝塊內(nèi)有大量的血小板、中性粒細(xì)胞、ROS 和釋放的 DNA(圖 3A)。 HIT 患者的循環(huán)血小板和中性粒細(xì)胞也產(chǎn)生了更多的 ROS。

HIT 中的血栓形成需要中性粒細(xì)胞衍生的 ROS

當(dāng)研究人員分析血栓時,他們發(fā)現(xiàn)血凝塊內(nèi)有大量的血小板、中性粒細(xì)胞、ROS 和釋放的 DNA(圖 3A)。HIT 患者的循環(huán)血小板和中性粒細(xì)胞也產(chǎn)生了更多的 ROS。

圖 3A 來自 Chong 等人。HIT IgG 誘導(dǎo)的 NETosis 和含有 ROS 的血栓。(A)全血中 KKO 誘導(dǎo)的血栓的共聚焦顯微鏡圖像,顯示血小板(紅色)、中性粒細(xì)胞(綠色)、ROS(洋紅色)和 DNA 釋放(藍(lán)色)。

KKO 和 HIT IgG 誘發(fā)的血栓顯示細(xì)胞外 DNA、血小板和中性粒細(xì)胞明顯沉積(圖 4 A-B)。用 DPI 處理血液可顯著減少這些成分和血凝塊大小。這一觀察結(jié)果證實(shí)了 ROS 在 HIT 相關(guān)血栓形成中的核心作用。

圖 4A-B 來自 Chong 等人。抑制 ROS 可減少血凝塊形成和流動條件下的 NET 釋放。(A)用同型對照和肝素或 KKO 和肝素加載體對照或 DPI 處理的全血的熒光圖像。(B)用正常人 IgG (hIgG) 和肝素或代表性 HIT IgG 和肝素加載體對照或 DPI 處理的全血。細(xì)胞外 DNA(藍(lán)色)、中性粒細(xì)胞(綠色)和血小板(紅色)。

HIT 中的中性粒細(xì)胞衍生 ROS 和血栓形成

在用載體處理的中性粒細(xì)胞重建的 HIT IgG 處理血液中,研究人員觀察到充滿細(xì)胞外 DNA、中性粒細(xì)胞和血小板的大凝塊。他們在用正常 IgG 處理的重建血液中沒有觀察到這些特征(圖 5)。

圖 5 來自 Chong 等人。針對中性粒細(xì)胞的 ROS 抑制阻斷了全血中的 NET 和血栓形成。(A)熒光圖像顯示細(xì)胞外 DNA(藍(lán)色)、中性粒細(xì)胞(綠色)和血小板(紅色)。

用 DPI 處理重組血液可顯著減少 HIT IgG 治療后的 DNA、中性粒細(xì)胞和血小板沉積。

這些數(shù)據(jù)表明中性粒細(xì)胞衍生的 ROS 與 HIT 中的血栓形成之間存在直接聯(lián)系。

本研究中的其他實(shí)驗(yàn)

中性粒細(xì)胞中的 ROS 生成

實(shí)驗(yàn)涉及用 HIT 患者 IgG 或 KKO、PF4 和肝素刺激純化的中性粒細(xì)胞。KKO 處理的中性粒細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的 ROS 生成。

HIT IgG 介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞活化和 NETosis

該實(shí)驗(yàn)涉及在肝素存在下用 KKO 或 HIT IgG 治療健康血液。與對照組相比,治療增加了全血和 LDG 群體中經(jīng)歷 NETosis 的中性粒細(xì)胞。DNP 和 DPI 阻斷了 HIT IgG 誘導(dǎo)的 LDG 中的 ROS 生成。

體內(nèi)研究

該小組還使用表達(dá)人類 Fc?RIIa 的 R131 異構(gòu)體和人類 PF416 的雙轉(zhuǎn)基因 Fc?RIIa+/hPF4+ 小鼠進(jìn)行了動物研究。他們注射了 HIT 樣單克隆抗體 KKO 和肝素以在這些動物中誘導(dǎo) HIT。然后,他們給動物施用 ROS 抑制劑,并分析其肺部和血小板計(jì)數(shù)。

這些實(shí)驗(yàn)的主要發(fā)現(xiàn)

  • 未經(jīng) DPI 治療的 KKO 治療小鼠肺部出現(xiàn)大量發(fā)光積累。DPI 治療降低了發(fā)光,表明 ROS 受到抑制。(補(bǔ)充圖 5A)
  • 經(jīng) DPI 治療的 HIT 小鼠循環(huán)中活化中性粒細(xì)胞 (LDG) 和 ROS+ 細(xì)胞減少,與對照水平相似。這些結(jié)果與微流體觀察結(jié)果一致,其中 ROS 抑制阻斷了中性粒細(xì)胞活化。(補(bǔ)充圖 5D)
  • 用 KKO 和肝素治療的小鼠肺部出現(xiàn)密集的血小板積聚和血栓形成。(圖 6)
  • 用 DPI 抑制 ROS 可減少 HIT 誘導(dǎo)的血栓形成,支持微流體研究。
  • DPI 無法預(yù)防血小板減少和體溫過低。

結(jié)論

研究人員得出結(jié)論:

  • ROS 和 NOX2 在 HIT 中的 NETosis 和血栓形成中起著至關(guān)重要的作用。
  • NOX2 可能是 HIT 抗血栓治療的新治療靶點(diǎn)。
點(diǎn)成解決方案

實(shí)驗(yàn)室解決方案

如果您對上述實(shí)驗(yàn)感興趣,這是您在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)所需的設(shè)備:

  • 點(diǎn)成Vena8 Fluoro+ 生物芯片 – 模擬人體血管和血凝塊,詳情見下方鏈接。
  • 點(diǎn)成Mirus Evo 泵或 點(diǎn)成ExiGo 泵 – 控制生物芯片中的剪切速率(流速);這使您可以將剪切速率設(shè)置為模擬微血管或其他血管中血栓形成的流速的設(shè)置。
  • 微環(huán)境室 – 這是一個溫控框架,生物芯片位于其中,它將所有溫度保持在 370C。微環(huán)境室位于顯微鏡臺上。
  • 倒置顯微鏡 – 我們提供帶有 VenaFlux Pro 選項(xiàng)的 Zeiss AxioVert A1 或帶有 VenaFlux Elite 選項(xiàng)的 Zeiss AxioObserver7。
  • 數(shù)碼相機(jī) – 用于捕捉圖像和視頻錄制。我們?yōu)?Prime BSI Express 提供 VenaFlux Pro 和 Elite 選項(xiàng)。這是一款出色的相機(jī),具有高幀率,適合血栓研究。
  • Image Pro 細(xì)胞分析軟件 – 用于分析實(shí)驗(yàn)中的圖像和視頻。

如果您的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)擁有其中一些物品(如倒置顯微鏡、相機(jī)或細(xì)胞分析軟件),我們推薦 VenaFlux 入門套件。

點(diǎn)成Vena8 Fluoro+ 生物芯片

點(diǎn)成Mirus Evo™ 納米泵

點(diǎn)成ExiGo微流體注射泵

參考文獻(xiàn)

Leung, Halina HL, et al. “Inhibition of NADPH oxidase blocks NETosis and reduces thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.” Blood Advances 5.23 (2021): 5439-5451.

關(guān)鍵詞:顯微鏡
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